monoklonaalisia vasta-aineita voidaan tuottaa monissa eri solulinjoissa laitoksissamme. Mutta suosimme kiinanhamsterin munasarjan (CHO) tai ihmisen alkion munuaisen (Hek) solulinjoja, koska ne kasvavat voimakkaasti ja pystyvät suorittamaan ihmisen kaltaisen glykosylaation monoklonaalisten vasta-aineiden Fc-alueella.
optimoidut työnkulkumme ja aikataulumme monoklonaaliselle vasta-ainetuotannolle voidaan eritellä seuraavasti:
- vasta-aineiden sekvensointi, kun sekvenssejä ei ole vielä saatavilla (2-3 viikkoa vaihtelevilla alueilla ja leader-sekvensseillä; 3-4 viikkoa kokopitkässä sekvenssissä)
- puhdistetuista proteiineista (massaspektripohjainen sekvensointi)
- hybridoomasolulinjoista (transkriptomipohjainen sekvensointi)
- sopivan ekspressiovektorin valinta, geenisynteesi ja vasta-aineita koodaavien geenien Kloonaus-alkaen 2-3 viikon kuluttua
- Transfektio
- ohimenevä ekspressio lyhytaikaisissa hankkeissa tai pienessä/keskisuuressa tuotannossa (3-4 viikon kuluttua)
- vakaan solulinjan tuottaminen pitkäaikaisissa hankkeissa, kaupallisessa ja laajamittaisessa tuotannossa (5 kuukauden kuluttua)
- tuotannon mittakaava ja puhdistus (läpimenoajat riippuvat määrästä)
monoklonaalisten vasta-aineiden ohimenevä ilmentyminen riittää useimmissa käyttökohteissa. Näissä tapauksissa verensiirto -, tuotanto-ja puhdistusvaiheet (edellä kuvatut prosessin vaiheet 4 ja 5) alkavat vaaditusta saanto-ja puhtaustasosta riippuen 3-4 viikon kuluttua. Transienttiekspression tuottamia monoklonaalisia vasta-aineita käytetään alustavissa karakterisointitutkimuksissa, tutkimusprojekteissa ja prekliinisissä testeissä.
sitä vastoin, kun vasta-aineet on tarkoitettu terapeuttisiin sovelluksiin tai käytettäväksi in vitro-diagnostiikan ja lääkinnällisten laitteiden komponentteina, on muodostettava stabiileja solulinjoja. Näissä tapauksissa, verensiirto, seulonta, ja subcloning alkaa 5-6 kuukautta. Minkä tahansa vakaan solulinjan tuotantoprosessin suurimmat haasteet johtuvat monoklonin valinnan ja vakauden vahvistamisen työvoimavaltaisesta ja aikaa vievästä prosessista.
yksityiskohtaisesti vektorin transfektiossa saadaan stabiileja pooleja (useiden kloonien seos) ja vahvistetaan. Näiden poolien alustava Luonnehdinta auttaa tutkijoita tunnistamaan ne, joilla on suurin ja tasaisin tuotantosato. Tämän jälkeen monoklonin eristämiseen valitaan erittäin tuottavia altaita. Monoklonit määritellään erityiseksi alapopulaatioksi, joka on lähtöisin yhdestä solusta, joten monokloneilla on sama geneettinen tausta stabiilisti integroituneiden vektorien ja samankaltaisten tuotantosatojen kanssa.
”klonaalisuuden” varmistaminen voi olla erityisen haastavaa nisäkässolulinjojen kanssa työskenneltäessä, koska yksittäisten solujen eristäminen on vaikeaa. Tällä hetkellä Monoklonin eristäminen Proteogenixillä voidaan suorittaa käyttämällä jompaakumpaa kahdesta päästrategiasta:
- Monoklonin valinta käyttäen rajoittavaa laimennusmenetelmää (alkaen 4 kuukauden kuluttua) – tämä menetelmä on tavanomainen lähestymistapa monoklonin valintaan, ja se vaatii useita laimennus-ja vahvistuskierroksia, jotta solujen tiheys kussakin kuopassa voidaan rajoittaa minimiin (ihannetapauksessa yksi solu kuoppaa kohti). Vaikka halvempaa kuin muut menetelmät, rajoittamalla laimennus on merkittäviä haittoja, mukaan lukien se, että se voi olla erittäin työvoimavaltaista ja aikaa vievää. Lisäksi solujen määrän rajoittaminen kaivoa kohti laimentamalla mahdollistaa vain runsaimpien kloonien eristämisen – jotka eivät ehkä ole kaikkein tuottavimpia.
- Monoklonin valinta käyttäen todennettua In Situ-Levykylvömenetelmää (VIPS™) (alkaen 4 kuukauden iässä) – VIPS™ – menetelmä on edistyksellinen lähestymistapa monoklonin valintaan. Se on vähemmän työvoimavaltainen kuin tavanomainen lähestymistapa; se vaatii kuitenkin erikoislaitteiden käyttöä. VIPS™ – laite suunniteltiin kylvämään yksittäiset solut automaattisesti 96 tai 384 kuoppamikroplaattiin. Perinteisestä menetelmästä poiketen useimmat yksittäiset kloonit eristetään ja arvioidaan ennen vahvistusta, jolloin tutkijat voivat valita parhaat ehdokkaat – jotka eivät välttämättä ole runsaimpia.
koska kloonien vahvistussyklejä on vähemmän, VIPS™ – menetelmä mahdollistaa nopeamman ja vankemman lähestymistavan monoklonien seulontaan ja valintaan. Lisäksi 5-6 kuukauden iässä alkavaa stabiilia solulinjan tuotantoa voidaan onnistuneesti vähentää useilla viikoilla.