monoklonális antitesteket számos különböző sejtvonalban lehet előállítani létesítményeinkben. De előnyben részesítjük a kínai hörcsög petefészek (CHO) vagy a humán embrionális vese (HEK) sejtvonalakat, mivel robusztus növekedésük és a monoklonális antitestek Fc doménjén képesek emberszerű glikozilezésre.
optimalizált munkafolyamatunk és a monoklonális antitest-termelésre vonatkozó ütemterveink a következők szerint részletezhetők:
- Antitestszekvenálás, ha a szekvenciák még nem állnak rendelkezésre (2-3 hét változó régiók és leader szekvenciák esetén; 3-4 hét a teljes hosszúságú szekvencia esetében)
- tisztított fehérjékből (tömegspektrum alapú szekvenálás)
- hibridoma sejtvonalakból (transzkriptomikus alapú szekvenálás)
- a megfelelő expressziós vektor kiválasztása, génszintézis és antitest-kódoló gének klónozása-2-3 héttől kezdve
- transzfekció
- Átmeneti expresszió rövid távú projektekhez vagy kis/közepes méretű termeléshez (3-4 héttől kezdve)
- stabil sejtvonal-generáció hosszú távú projektekhez, Kereskedelmi és nagyüzemi termeléshez (5 hónaptól kezdve)
- termelési méretarány és tisztítás (az átfutási idő mennyiségfüggő)
a monoklonális antitestek Átmeneti expressziója elegendő a legtöbb alkalmazáshoz. Ezekben az esetekben a szükséges hozamtól és tisztasági szinttől függően a transzfekciós, előállítási, tisztítási szakaszok (a fent bemutatott eljárás 4.és 5. lépése) 3-4 hét múlva kezdődnek. A tranziens expresszióval előállított monoklonális antitesteket előzetes jellemzési vizsgálatokban, kutatási projektekben és preklinikai tesztekben használják.
ezzel szemben, ha az antitesteket terápiás célokra szánják, vagy in vitro diagnosztika és orvostechnikai eszközök komponenseként használják, stabil sejtvonalakat kell létrehozni. Ezekben az esetekben a transzfekció, a szűrés és az alklónozás 5-6 hónapnál kezdődik. Bármely stabil sejtvonal-előállítási folyamat fő kihívásai a monoklon szelekció és a stabilitás megerősítésének munkaigényes és időigényes folyamatából származnak.
részletesen, a vektor transzfekciója után stabil medencéket (több klón keverékét) kapunk és amplifikálunk. Ezeknek a készleteknek az előzetes jellemzése lehetővé teszi a kutatók számára, hogy azonosítsák azokat, amelyek a legmagasabb és legkövetkezetesebb termelési hozammal rendelkeznek. Ezt követően rendkívül produktív medencéket választanak ki a monoklon izolálásához. A monoklonokat úgy definiáljuk, mint egy specifikus szubpopulációt, amely egyetlen sejtből származik, így a monoklonok ugyanolyan genetikai háttérrel rendelkeznek, stabilan integrált vektorokkal és hasonló termelési hozamokkal.
a “klonalitás” biztosítása különösen kihívást jelenthet emlős sejtvonalakkal végzett munka során, mivel az egyes sejtek izolálása nehéz. Jelenleg a ProteoGenix monoklon izolálása a két fő stratégia egyikével hajtható végre:
- Monoklon szelekció a korlátozó hígítási módszerrel (4 hónaptól kezdődően) – ez a módszer a monoklon szelekció hagyományos megközelítése, és több hígítási és amplifikációs kört igényel, hogy az egyes kutakban a sejtsűrűséget minimálisra korlátozza (ideális esetben egy cellánként). Bár olcsóbb, mint más módszerek, a hígítás korlátozása fontos hátrányokkal jár, beleértve azt a tényt, hogy rendkívül munkaigényes és időigényes lehet. Sőt, a kútonkénti sejtek számának hígítással történő korlátozása csak a leggyakoribb klónok izolálását teszi lehetővé-amelyek esetleg nem a legtermékenyebbek.
- Monoklon kiválasztás az ellenőrzött In-Situ lemezes vetés (VIPS) módszer alkalmazásával (4 hónaptól kezdve) – a VIPS 6 módszer a monoklon szelekció fejlett megközelítése. Kevésbé munkaigényes, mint a hagyományos megközelítés; azonban speciális berendezések használatát igényli. A VIP-eket úgy tervezték, hogy az egyes cellákat automatikusan 96 vagy 384 kút mikrolemezbe ültessék. A hagyományos módszerrel ellentétben a legtöbb egyes klónt izolálják és értékelik az amplifikáció előtt, lehetővé téve a kutatók számára, hogy kiválasszák a legjobb jelölteket – amelyek talán nem a leggyakoribbak.
a klón amplifikációs ciklusok alacsonyabb száma miatt a vips (vips) módszer lehetővé teszi a monoklon szűrés és kiválasztás gyorsabb és robusztusabb megközelítését. Sőt, a stabil sejtvonal-generáció, amely 5-6 hónap múlva kezdődik, több héttel sikeresen csökkenthető.