Olá pessoal! Eu queria saber se alguém poderia me dizer como funciona o tampão de lise de glóbulos vermelhos. Que Função os ingredientes têm?
eu usei esta receita:
1 l ddH20
8.26 g de Cloreto de Amónio (NH4Cl)
1 g de Bicarbonato de Potássio (KHCO3)
0.037 g de EDTA
pH 7,3
O boato de que ele tem algo a ver com o Na+/K+ATPase atividade, mas isso não é tão detalhado como eu gostaria de saber como ele funciona.
eu apreciaria muito uma explicação de como esse buffer funciona, ou talvez uma dica de onde posso encontrar litterature, ou algo parecido, sobre isso.
obrigado!
vamos lá rapazes! 80 visualizações e nem uma única resposta! Minha pergunta não está clara? Será Que ninguém sabe ou nenhum corpo se importa em ajudar um cara?Apenas uma dica sobre onde eu poderia ler sobre isso também seria muito apreciada!
-CTC-
A outra opção é que muitos desses 80 pós espectadores passou algum tempo a olhar para este para você (como eu, que passou mais de uma hora na internet tentando descobrir) e não consegui encontrar nada mais do que o que você já sabe……….
leelee em Sex Nov 12 07: 43: 39 2010 disse:
Bem, isso também é possível, eu acho. Peço desculpas a todos vocês, pessoas legais que tentaram me ajudar, e também agradeço seu tempo e esforço!
Desculpe reviver tal e velho fio, mas eu também estava interessado em saber a resposta. Em outro fórum, alguém usar de Tris em vez de potássio biocarbonate e ainda funcionou, então eu não vejo como poderia ser de Na+/K+ bombas
http://www.scienceforums.net/topic/13565-rbc-lysis/
Querido CTC,
por Favor, consulte a referência abaixo:-
http://ir.library.oregonstate.edu/xmlui/bitstream/handle/1957/13985/Schreck.AnalysisSalmonidLeukocytes.pdf?sequence=3
A parte importante é:-
Mamíferos hemácias colocadas em água destilada
vai inchar até que em algum ponto crítico nascente
pressão no interior da célula supera a resistência à tração
força da membrana celular e a hemoglobina escapa
(hemólise). Delano (1995) desenvolveu um modelo
para prever o conjunto crítico de condições físicas
que resultam em ruptura osmótica de eritrócitos de mamíferos
. O modelo determinou que o destino
do eritrócito em uma solução hipotônica depende
da tonicidade, da esfericidade inicial da célula,
da fração inicial de seu volume não ocupado por
água e da quantidade fracionária máxima em
que a área de superfície pode ser esticada.
temos vindo a utilizar o seu tampão de lise (NH4CL) para remover os glóbulos vermelhos do isolamento Ficoll-Paque de sangue total. Os RBC são um contaminante indesejável como nós somos após neutrófilos, monócitos, plaquetas etc. Ao usar este tampão de lise, essas células não são ativadas de forma alguma para arruinar nossos experimentos, ou seja, degranulação e quimiotaxia de neutrófilos.
espero que isso lhe dê um pouco mais de compreensão do que está envolvido na lise hipotônica do RBC
Atenciosamente
tio Losango
Olá!
passei as últimas horas procurando uma resposta para esta pergunta e pensei em postar para referência futura.
diferentes fontes afirmam coisas diferentes. Esta é basicamente uma combinação do que encontrei…
se adicionarmos todo o sangue à água destilada pura, todas as células acabarão por se abrir devido à pressão osmótica. Portanto, temos que modificar o procedimento porque queremos apenas que os glóbulos vermelhos se espalhem.
NH4Cl: faz o RBC inchar, porque a penetração de NH3 induz uma troca transmembrana entre os íons Cl E OH.
KHCO3: aumenta a taxa de inchaço do RBC e também pode servir como um componente tampão.
EDTA: Ele se liga A Mg + 2 e Ca+2, o que desestabiliza a membrana RBC, mas não afeta tanto os glóbulos brancos, por isso nos permite atingir apenas o RBC. É também um detergente de sal que acabará por regular a acidez e osmolaridade do lisado e protege nosso DNA das nucleases (ligando-se aos íons que servem como cofatores para essas enzimas).
-Lunamae-
O ponto principal foi, provavelmente, fazer algum tipo de buffer, que é seguro para outras células, mas de explorar as características específicas das Hemácias, a sua limitada capacidade de resistir ao estresse osmótico.
o raeson para adição de EDTA também pode ser mais a inibição de enzimas degradatórias liberadas de células rompidas, em vez de ajudar na lise.
Olá,
algum renascimento deste tópico antigo.. Alguém sabe uma maneira de parar a lise das células por este buffer? Eu uso o buffer ACK para Lyse RBCs após o isolamento Ficoll de PBMCs. O fato é que, se excedermos o tempo de 5 minutos para a lise, os PBMCs também sofrem e preciso adicionar o trypan blue e correr para outra sala para contar células via Máquina TC20. Então, eu me pergunto como representativo é a contagem que recebo se o buffer ACK ainda estiver agindo até que o TC20 forneça meu resultado em duplicado….?
obrigado antecipadamente!
sua melhor aposta seria lavar os PBMCs em um buffer antes de começar a contar: girar as células, remover o buffer ACK, substituir por PBS ou solução semelhante (por exemplo, Ringer?), então pegue uma alíquota para contar.