anticorpos monoclonais podem ser produzidos em muitas linhas celulares diferentes em nossas instalações. Mas nós favorecemos o ovário chinês do hamster (CHO) ou as linhas celulares embrionárias humanas do rim (HEK) devido a seus crescimento robusto e capacidade executar humano-como a glicosilação no domínio de Fc de anticorpos monoclonais.
nosso fluxo de trabalho otimizado e cronogramas para produção de anticorpos monoclonais podem ser detalhados da seguinte forma:
- sequenciamento de anticorpos quando as sequências ainda não estão disponíveis (2-3 semanas para regiões variáveis e sequências leader; 3-4 semanas para o full-length sequence)
- a Partir de proteínas purificadas (massa espectros base de seqüenciamento)
- a Partir de linhas de células de hibridoma (transcriptomic baseado no sequenciamento)
- a Escolha de um vetor de expressão, gene síntese, e a clonagem de anticorpos de codificação de genes – a partir de 2-3 semanas
- Transfection
- expressão Transitória para projetos de curto prazo ou de pequena/média escala de produção (a partir de 3-4 semanas)
- Estável linha celular de geração para projetos de longo prazo, comercial e de produção em grande escala (a partir do 5 meses)
- escala de produção e purificação (os prazos de entrega são dependentes da quantidade)
a expressão transitória de anticorpos monoclonais é suficiente para a maioria das aplicações. Nesses casos, dependendo dos níveis de rendimento e pureza necessários, os estágios de transfecção, produção e purificação (etapas 4 e 5 no processo descrito acima) começam de 3 a 4 semanas. Anticorpos monoclonais produzidos por expressão transitória são usados em estudos preliminares de caracterização, projetos de pesquisa e testes pré-clínicos.
em contraste, quando os anticorpos são destinados a aplicações terapêuticas ou para serem usados como componentes de diagnósticos in vitro e dispositivos médicos, linhas celulares estáveis devem ser geradas. Nesses casos, a transfecção, triagem e subclonamento começam em 5-6 meses. Os principais desafios de qualquer processo de geração de linha celular estável derivam do processo trabalhoso e demorado de seleção de monoclones e confirmação de estabilidade.
em detalhes, após a transfecção do vetor, pools estáveis (uma mistura de vários clones) são obtidos e amplificados. A caracterização preliminar desses pools permite aos pesquisadores identificar aqueles com o maior e mais consistente rendimento de produção. Posteriormente, pools altamente produtivos são selecionados para isolamento monoclônico. Os Monoclones são definidos como uma subpopulação específica originada de uma única célula, portanto, os monoclones compartilham o mesmo fundo genético com vetores estáveis integrados e rendimentos de produção semelhantes.
garantir a “clonalidade” pode ser particularmente desafiador ao trabalhar com linhagens celulares de mamíferos devido à dificuldade em isolar células únicas. Atualmente, monoclone isolamento no ProteoGenix pode ser realizada através de um dos dois principais estratégias:
- Monoclone seleção utilizando a limitação método de diluição (a partir de 4 meses) – este método é a abordagem convencional para monoclone seleção e requer várias rodadas de diluição e de amplificação para limitar a densidade das células em cada poço a um mínimo (de preferência uma de células por poço). Embora menos caro do que outros métodos, limitar a diluição tem desvantagens importantes, incluindo o fato de que pode ser extremamente trabalhoso e demorado. Além disso, limitar o número de células por poço por diluição só permitirá o isolamento dos clones mais abundantes – que podem não ser os mais produtivos.
- seleção de Monoclones usando o método de semeadura de placas In Situ verificada (VIPS™) (a partir de 4 meses) – o método VIPS™ é uma abordagem avançada para a seleção de monoclones. É menos trabalhoso do que a abordagem convencional; no entanto, requer o uso de equipamentos especializados. O equipamento VIPS™ foi projetado para semear automaticamente células individuais em microplacas de 96 ou 384 poços. Em contraste com o método tradicional, a maioria dos clones únicos são isolados e avaliados antes da amplificação, permitindo que os pesquisadores escolham os melhores candidatos – o que pode não ser o mais abundante.
dado o menor número de ciclos de amplificação de clones, o método VIPS™ permite uma abordagem mais rápida e robusta para triagem e seleção de monoclones. Além disso, a geração estável da linha celular, que começa em 5-6 meses, pode ser reduzida com sucesso por várias semanas.