anticorpii monoclonali pot fi produși în multe linii celulare diferite la unitățile noastre. Dar favorizăm liniile celulare ovariene de hamster chinezesc (CHO) sau rinichi embrionar uman (HEK) datorită creșterii robuste și capacității lor de a efectua glicozilare asemănătoare omului pe domeniul Fc al anticorpilor monoclonali.
fluxul nostru de lucru optimizat și termenele pentru producția de anticorpi monoclonali pot fi detaliate după cum urmează:
- secvențierea anticorpilor atunci când secvențele nu sunt încă disponibile (2-3 săptămâni pentru regiunile variabile și secvențele leader; 3-4 săptămâni pentru secvența de lungime completă)
- din proteine purificate (secvențiere bazată pe spectrele de masă)
- din liniile celulare hibridoma (secvențiere bazată pe transcriptomic)
- alegerea vectorului de Expresie adecvat, sinteza genelor și clonarea genelor care codifică anticorpi-începând de la 2-3 săptămâni
- transfecție
- Expresie tranzitorie pentru proiecte pe termen scurt sau producție la scară mică/medie (începând de la 3-4 săptămâni)
- generație de linii celulare stabile pentru proiecte pe termen lung, producție comercială și pe scară largă (începând de la 5 luni)
- extinderea producției și purificarea (timpii de plumb sunt dependenți de cantitate)
expresia tranzitorie a anticorpilor monoclonali este suficientă pentru majoritatea aplicațiilor. În aceste cazuri, în funcție de nivelurile de randament și puritate necesare, etapele de transfecție, producție, purificare (etapele 4 și 5 din procesul descris mai sus) încep de la 3 până la 4 săptămâni. Anticorpii monoclonali produși prin Expresie tranzitorie sunt utilizați în studii preliminare de caracterizare, proiecte de cercetare și teste preclinice.
în schimb, atunci când anticorpii sunt destinați aplicațiilor terapeutice sau pentru a fi utilizați ca componente ale diagnosticului in vitro și ale dispozitivelor medicale, trebuie generate linii celulare stabile. În aceste cazuri, transfecția, screeningul și Subclonarea încep la 5-6 luni. Provocările majore ale oricărui proces stabil de generare a liniei celulare derivă din procesul intensiv de muncă și consumator de timp de selecție monoclonă și confirmare a stabilității.
în detaliu, la transfecția vectorului, se obțin și se amplifică bazine stabile (un amestec de mai multe clone). Caracterizarea preliminară a acestor bazine permite cercetătorilor să-i identifice pe cei cu cel mai mare și mai consistent randament de producție. Ulterior, piscinele foarte productive sunt selectate pentru izolarea monoclonelor. Monoclonele sunt definite ca o subpopulație specifică provenită dintr-o singură celulă, astfel, monoclonele împărtășesc același fond genetic cu vectori integrați stabil și randamente de producție similare.
asigurarea „clonalității” poate fi deosebit de dificilă atunci când se lucrează cu linii celulare de mamifere din cauza dificultății de izolare a celulelor unice. În prezent, izolarea monoclonei la ProteoGenix poate fi efectuată utilizând una dintre cele două strategii majore:
- selecția Monoclonei folosind metoda de diluare limitativă (începând cu 4 luni) – această metodă este abordarea convențională a selecției monoclonei și necesită mai multe runde de diluare și amplificare pentru a limita densitatea celulară în fiecare godeu la minimum (în mod ideal o celulă pe godeu). Deși mai puțin costisitoare decât alte metode, limitarea diluției are dezavantaje importante, inclusiv faptul că poate fi extrem de consumatoare de timp și consumatoare de timp. Mai mult, limitarea numărului de celule pe godeu prin diluare va permite doar izolarea celor mai abundente clone – care ar putea să nu fie cele mai productive.
- selectia Monoclonelor folosind metoda verificata in Situ de insamantare a placilor (VIPS in situ) (incepand cu 4 luni)-metoda VIPs in situ reprezinta o abordare avansata a selectiei monoclonelor. Este mai puțin intensiv în muncă decât abordarea convențională; cu toate acestea, necesită utilizarea de echipamente specializate. Echipamentul VIP-uri a fost proiectat pentru însămânțarea automată a celulelor individuale în 96 sau 384 de microplăci. Spre deosebire de metoda tradițională, majoritatea clonelor unice sunt izolate și evaluate înainte de amplificare, permițând cercetătorilor să aleagă cei mai buni candidați – care ar putea să nu fie cei mai abundenți.
având în vedere numărul mai mic de cicluri de amplificare a clonelor, metoda VIP-urilor permite o abordare mai rapidă și mai robustă a screeningului și selecției monoclonice. Mai mult, generarea stabilă a liniei celulare, care începe la 5-6 luni, poate fi redusă cu succes cu câteva săptămâni.