monoklonální protilátky mohou být produkovány v mnoha různých buněčných liniích v našich zařízeních. Upřednostňujeme však buněčné linie vaječníků čínského křečka (CHO) nebo lidských embryonálních ledvin (HEK) kvůli jejich robustnímu růstu a schopnosti provádět glykosylaci podobnou člověku na Fc doméně monoklonálních protilátek.
náš optimalizovaný pracovní postup a časové osy pro produkci monoklonálních protilátek lze podrobně popsat následovně:
- sekvenování protilátek, pokud sekvence ještě nejsou k dispozici (2-3 týdny pro variabilní oblasti a leader sekvence;
- z purifikovaných proteinů (sekvenování založené na hmotnostních spektrech)
- z buněčných linií hybridomu(sekvenování na bázi transkriptomu)
- volba adekvátního expresního vektoru, syntéza genů a klonování genů kódujících protilátky-počínaje 2-3 týdny
- transfekce
- přechodná exprese pro krátkodobé projekty nebo malou/střední produkci (počínaje 3-4 týdny)
- stabilní generování buněčné linie pro dlouhodobé projekty, komerční a velkovýrobu (počínaje 5 měsíci)
- výroba scale-up a čištění (dodací lhůty jsou závislé na množství)
pro většinu aplikací postačuje přechodná exprese monoklonálních protilátek. V těchto případech, v závislosti na požadované úrovni výtěžku a čistoty, začínají fáze transfekce, výroby, čištění (kroky 4 a 5 ve výše uvedeném procesu) 3 až 4 týdny. Monoklonální protilátky produkované přechodnou expresí se používají v předběžných charakterizačních studiích, výzkumných projektech a předklinických testech.
naproti tomu, pokud jsou protilátky určeny pro terapeutické aplikace nebo mají být použity jako součásti diagnostiky in vitro a zdravotnických prostředků, musí být vytvořeny stabilní buněčné linie. V těchto případech začíná transfekce, screening a subklonování po 5-6 měsících. Hlavní výzvy jakéhokoli procesu generování stabilní buněčné linie vyplývají z pracného a časově náročného procesu výběru monoklonů a potvrzení stability.
podrobně se při transfekci vektoru získávají a zesilují stabilní bazény (směs několika klonů). Předběžná charakterizace těchto fondů umožňuje vědcům identifikovat ty s nejvyšším a nejkonzistentnějším produkčním výnosem. Následně jsou vybrány vysoce produktivní bazény pro izolaci monoklonů. Monoklony jsou definovány jako specifická subpopulace pocházející z jedné buňky, tím pádem, monoklony sdílejí stejné genetické pozadí se stabilně integrovanými vektory a podobnými produkčními výnosy.
zajištění „klonality“ může být obzvláště náročné při práci s buněčnými liniemi savců kvůli obtížnosti izolace jednotlivých buněk. V současné době lze izolaci monoklonu v ProteoGenix provést pomocí jedné ze dvou hlavních strategií:
- výběr Monoklonu metodou omezujícího ředění (počínaje 4 měsíci) – tato metoda je konvenční přístup k výběru monoklonu a vyžaduje několik kol ředění a amplifikace, aby se omezila hustota buněk v každé jamce na minimum (ideálně jedna buňka na jamku). Přestože je omezení ředění levnější než jiné metody, má důležité nevýhody, včetně skutečnosti, že může být extrémně náročné na práci a časově náročné. Navíc omezení počtu buněk na jamku zředěním umožní pouze izolaci nejhojnějších klonů – které nemusí být nejproduktivnější.
- výběr Monoklonu metodou Verified in-Situ Plate Seeding (VIPS™) (počínaje 4 měsíci) – metoda VIPS™ je pokročilým přístupem k výběru monoklonu. Je méně náročný na práci než konvenční přístup, vyžaduje však použití specializovaného vybavení. Zařízení VIPS™ bylo navrženo tak, aby automaticky osévalo jednotlivé buňky do mikrodestiček 96 nebo 384 jamek. Na rozdíl od tradiční metody je většina jednotlivých klonů izolována a vyhodnocena před amplifikací, což vědcům umožňuje vybrat nejlepší kandidáty – což nemusí být nejhojnější.
vzhledem k nižšímu počtu cyklů zesílení klonů umožňuje metoda VIPS™ rychlejší a robustnější přístup k screeningu a výběru monoklonů. Kromě toho může být stabilní generace buněčné linie, která začíná po 5-6 měsících, úspěšně snížena o několik týdnů.