Ahoj lidi! Zajímalo by mě, jestli by mi někdo mohl říct, jak funguje pufr na lýzu červených krvinek. Jakou funkci mají složky?
použil jsem tento recept:
1 l ddH20
8.26 g chloridu amonného (NH4Cl)
1 g hydrogenuhličitanu draselného (KHCO3)
0.037 g EDTA
pH 7.3
Říká se, že to má něco společného s aktivitou ATPázy Na+ / K+, ale to není tak podrobné, jak bych chtěl vědět, jak to funguje.
velmi bych ocenil vysvětlení, jak Tato vyrovnávací paměť funguje, nebo možná náznak, kde mohu najít litterature, nebo podobně, na tomto.
díky!
No tak, lidi! 80 zobrazení a ne jediná odpověď! Je moje otázka nejasná? Je možné, že nikdo neví nebo se nestará o to, aby pomohl chlapovi?Jen náznak o tom, kde bych mohl číst o tom by velmi ocenil, jakož!
druhou možností je, že mnoho z těchto 80 diváků strávilo nějaký čas hledáním toho pro vás (jako já, který strávil více než hodinu na internetu a snažil se to zjistit) a nemohl najít nic podrobnějšího, než co už víte……….
leelee na Pá Nov 12 07: 43: 39 2010 řekl:
No, to je také možné, myslím. Omlouvám se vám všem milým lidem, kteří se mi snažili pomoci, a také vám děkuji za Váš čas a úsilí!
Omlouvám se za oživení takového a starého vlákna, ale i já jsem měl zájem znát odpověď. Na jiném fóru někdo používá Tris místo biokarbonátu draselného a stále to fungovalo, takže nevidím, jak by to mohlo být z čerpadel Na+ / k+
http://www.scienceforums.net/topic/13565-rbc-lysis/
Vážení CTC,
viz níže uvedený odkaz:-
http://ir.library.oregonstate.edu/xmlui/bitstream/handle/1957/13985/Schreck.AnalysisSalmonidLeukocytes.pdf?sequence=3
důležitý bit je: –
savčí erytrocyty umístěné do destilované vody
budou bobtnat, dokud v určitém kritickém bodě rostoucí tlak
v buněčném vnitřku nepřekoná pevnost v tahu
buněčné membrány a hemoglobin neunikne
(hemolýza). Delano (1995) vyvinul model
, který předpovídá kritickou sadu fyzikálních podmínek
, které vedou k osmotickému prasknutí savčích
erytrocytů. Model stanovil, že
osud erytrocytů v hypotonickém roztoku závisí
na tonicitě, počáteční sféricitě buňky,
počáteční frakci jejího objemu neobsazeného
vodou a maximální frakční množství
, které může být povrchová plocha natažena.
použili jsme váš lyzační pufr (NH4CL) k odstranění červených krvinek z Ficoll-Paque izolace plné krve. RBC jsou nežádoucím kontaminantem, jako jsme po neutrofilech, monocytech, krevních destičkách atd. Použitím tohoto lýzního pufru nejsou tyto buňky aktivovány žádným způsobem, aby zničily naše experimenty, tj. degranulace a chemotaxe Neutrafilů.
doufám, že vám to poskytne více pochopení toho, co se podílí na hypotonické lýze RBC
nejlaskavější pozdravy
Strýček kosočtverec
Ahoj!
strávil jsem posledních několik hodin hledáním odpovědi na tuto otázku a myslel jsem, že zveřejním příspěvek pro budoucí použití.
různé zdroje tvrdí různé věci. To je v podstatě kombinace toho, co jsem našel…
pokud přidáme celou krev do čisté destilované vody, všechny buňky nakonec prasknou v důsledku osmotického tlaku. Takže musíme upravit postup, protože chceme, aby se červené krvinky lyzovaly.
NH4Cl: způsobuje bobtnání RBC, protože penetrace NH3 indukuje transmembránovou výměnu mezi ionty Cl a OH.
KHCO3: zvyšuje rychlost otoku RBC a může také sloužit jako vyrovnávací složka.
EDTA: Váže se na Mg + 2 A Ca+2, což destabilizuje membránu RBC, ale neovlivňuje tolik bílých krvinek, takže nám umožňuje zaměřit se pouze na RBC. Je také solný detergent, který nakonec reguluje kyselost a osmolaritu lyzátu a chrání naši DNA před nukleázami (vazbou na ionty, které slouží jako kofaktory pro tyto enzymy).
hlavním bodem bylo pravděpodobně vytvořit nějaký druh pufru, který je bezpečný pro jiné buňky, ale využívá specifické vlastnosti RBC, jejich omezenou schopnost odolávat osmotickému stresu.
raeson pro přidání EDTA může být také spíše inhibicí degradačních enzymů uvolňovaných z prasklých buněk, než aby pomohl lýze.
Dobrý den,
nějaké oživení tohoto starého tématu.. Ví někdo, jak zastavit lýzu buněk tímto pufrem? Používám ACK buffer k lyse RBC po Ficoll izolaci PBMCs. Jde o to, že pokud překročíme dobu 5 minut pro lýzu, pbmc také trpí a musím přidat trypan blue a běžet do jiné místnosti, abych počítal buňky pomocí stroje TC20. Zajímalo by mě, jak reprezentativní je počet, který dostanu, pokud vyrovnávací paměť ACK stále působí, dokud tc20 nedá můj výsledek ve dvojím vyhotovení….?
Děkuji předem!
vaše nejlepší sázka by bylo umýt Pbmc v pufru, než začnete počítat: Roztočte buňky, odstraňte vyrovnávací paměť ACK, nahraďte PBS nebo podobným roztokem(např.), pak vezměte alikvot pro počítání.