Monoklonale Antikörper können in unseren Anlagen in vielen verschiedenen Zelllinien hergestellt werden. Wir bevorzugen jedoch Ovariallinien des chinesischen Hamsters (CHO) oder Zelllinien der menschlichen embryonalen Niere (HEK) aufgrund ihres robusten Wachstums und ihrer Fähigkeit, eine menschenähnliche Glykosylierung in der Fc-Domäne monoklonaler Antikörper durchzuführen.
Unsere optimierten Arbeitsabläufe und Zeitpläne für die Produktion monoklonaler Antikörper können wie folgt beschrieben werden:
- Antikörpersequenzierung, wenn Sequenzen noch nicht verfügbar sind (2-3 Wochen für variable Regionen und Leader-Sequenzen; 3-4 Wochen für die Sequenz in voller Länge)
- Aus gereinigten Proteinen (Massenspektrenbasierte Sequenzierung)
- Aus Hybridomzelllinien (transkriptombasierte Sequenzierung)
- Auswahl des adäquaten Expressionsvektors, Gensynthese und Klonierung von Antikörper-kodierenden Genen – ab 2-3 Wochen
- Transfektion
- Transiente Expression für kurzfristige Projekte oder kleine/mittlere Produktion (ab 3-4 Wochen)
- Stabile Zellliniengenerierung für langfristige Projekte, kommerzielle und große Produktion (ab 5 Monaten)
- Produktion Scale-up und Reinigung (Lieferzeiten sind mengenabhängig)
Die transiente Expression monoklonaler Antikörper ist für die meisten Anwendungen ausreichend. In diesen Fällen beginnen die Transfektions-, Produktions- und Reinigungsstufen (Schritte 4 und 5 im oben dargestellten Verfahren) in Abhängigkeit von den erforderlichen Ausbeuten- und Reinheitsgraden bei 3 bis 4 Wochen. Monoklonale Antikörper, die durch transiente Expression hergestellt werden, werden in vorläufigen Charakterisierungsstudien, Forschungsprojekten und präklinischen Tests verwendet.
Wenn Antikörper dagegen für therapeutische Anwendungen oder als Bestandteile von In-vitro-Diagnostika und Medizinprodukten bestimmt sind, müssen stabile Zelllinien erzeugt werden. In diesen Fällen beginnen Transfektion, Screening und Subklonierung nach 5-6 Monaten. Die größten Herausforderungen bei der Erzeugung stabiler Zelllinien ergeben sich aus dem arbeitsintensiven und zeitaufwändigen Prozess der Monoklonselektion und Stabilitätsbestätigung.
Im Detail werden bei der Transfektion des Vektors stabile Pools (eine Mischung mehrerer Klone) erhalten und amplifiziert. Die vorläufige Charakterisierung dieser Pools ermöglicht es den Forschern, diejenigen mit der höchsten und konsistentesten Produktionsausbeute zu identifizieren. Anschließend werden hochproduktive Pools für die Monoklonisolation ausgewählt. Monoklone sind definiert als eine spezifische Subpopulation, die aus einer einzelnen Zelle stammt, daher teilen Monoklone den gleichen genetischen Hintergrund mit stabil integrierten Vektoren und ähnlichen Produktionsausbeuten.
Die Sicherstellung der „Klonalität“ kann bei der Arbeit mit Säugerzelllinien aufgrund der Schwierigkeit, einzelne Zellen zu isolieren, besonders schwierig sein. Derzeit kann die Monoklonisolation bei ProteoGenix unter Verwendung einer von zwei Hauptstrategien durchgeführt werden:
- Monoklonselektion unter Verwendung der Grenzverdünnungsmethode (ab 4 Monaten) – Diese Methode ist der herkömmliche Ansatz zur Monoklonselektion und erfordert mehrere Verdünnungs- und Amplifikationsrunden, um die Zelldichte in jeder Vertiefung auf ein Minimum zu begrenzen (idealerweise eine Zelle pro Vertiefung). Obwohl weniger teuer als andere Methoden, hat die Begrenzung der Verdünnung wichtige Nachteile, einschließlich der Tatsache, dass es extrem arbeitsintensiv und zeitaufwendig sein kann. Darüber hinaus ermöglicht die Begrenzung der Anzahl der Zellen pro Vertiefung durch Verdünnung nur die Isolierung der am häufigsten vorkommenden Klone – die möglicherweise nicht die produktivsten sind.
- Monoklonselektion mit der Verified In-Situ Plate Seeding (VIPS™)-Methode (ab 4 Monaten) – Die VIPS™ -Methode ist ein fortschrittlicher Ansatz für die Monoklonselektion. Es ist weniger arbeitsintensiv als der herkömmliche Ansatz, erfordert jedoch die Verwendung spezieller Geräte. Das VIPS ™ -Gerät wurde entwickelt, um einzelne Zellen automatisch in 96- oder 384-Well-Mikroplatten zu säen. Im Gegensatz zur traditionellen Methode werden die meisten Einzelklone vor der Amplifikation isoliert und ausgewertet, so dass die Forscher die besten Kandidaten auswählen können – die möglicherweise nicht die häufigsten sind.
Angesichts der geringeren Anzahl von Klonamplifikationszyklen ermöglicht die VIPS™ -Methode einen schnelleren und robusteren Ansatz für das Monoklonscreening und die Selektion. Darüber hinaus kann die stabile Zellliniengeneration, die bei 5-6 Monaten beginnt, erfolgreich um mehrere Wochen reduziert werden.