¡Hola gente! Me preguntaba si alguien podría decirme cómo funciona el tampón de lisis de glóbulos rojos. ¿Qué función tienen los ingredientes?
He utilizado esta receta:
1 l ddH20
8,26 g de Cloruro de amonio (NH4Cl)
1 g de Bicarbonato de potasio (KHCO3)
0,037 g EDTA
pH 7,3
Se rumorea que tiene algo que ver con la actividad de la ATPasa Na+/K+, pero esto no es tan detallado como me gustaría saber cómo funciona.
Agradecería mucho una explicación de cómo funciona este búfer, o tal vez una pista de dónde puedo encontrar literatura, o algo parecido, en esto.
Gracias!
vamos chicos! ¡80 visitas y ni una sola respuesta! ¿No está clara mi pregunta? ¿Puede ser que nadie sepa o no le importe a nadie ayudar a un tipo?¡Solo una pista sobre dónde podría leer sobre ella sería muy apreciada también!
La otra opción es que muchos de estos 80 espectadores de publicaciones pasaron algún tiempo investigando esto por ti (como yo, que pasé más de una hora en Internet tratando de averiguarlo) y no pude encontrar nada más detallado de lo que ya sabes……….
leelee el Vie Nov 12 07:43:39 2010 dijo:
Bueno, también es posible, supongo. Me disculpo con todos ustedes, buenas personas que trataron de ayudarme, y también les agradezco por su tiempo y esfuerzo.
Lamento revivir tal y viejo hilo, pero yo también estaba interesado en saber la respuesta. En otro foro, alguien usó Tris en lugar de biocarbonato de potasio y todavía funcionó, así que no veo cómo podría ser de las bombas Na+ / K +
http://www.scienceforums.net/topic/13565-rbc-lysis/
Estimado CTC,
Consulte la referencia a continuación:-
http://ir.library.oregonstate.edu/xmlui/bitstream/handle/1957/13985/Schreck.AnalysisSalmonidLeukocytes.pdf?sequence=3
El bit importante es:-
Los eritrocitos de mamíferos colocados en agua destilada
se hincharán hasta que en algún punto crítico la presión ascendente
en el interior de la célula supere la resistencia a la tracción
de la membrana celular y la hemoglobina escape
(hemólisis). Delano (1995) desarrolló un modelo
para predecir el conjunto crítico de condiciones físicas
que resultan en la ruptura osmótica de eritrocitos de mamíferos
. El modelo determinó que el destino
del eritrocito en una solución hipotónica depende
de la tonicidad, la esfericidad inicial de la célula,
la fracción inicial de su volumen no ocupada por
agua, y la cantidad fraccionada máxima por
que la superficie puede estirarse.
Hemos estado utilizando su tampón de lisis (NH4CL) para eliminar los glóbulos rojos del aislamiento de Ficoll-Paque de sangre completa. Los glóbulos rojos son un contaminante no deseado, ya que buscamos neutrófilos, Monocitos, Plaquetas, etc. Al usar este tampón de lisis, estas células no se activan de ninguna manera para arruinar nuestros experimentos, es decir, degranulación y quimiotaxis de neutrófilos.
Espero que esto le dé un poco más de comprensión de lo que está involucrado en la lisis hipotónica de los glóbulos rojos
Saludos cordiales
Tío Rombo
¡Hola!
He pasado las últimas horas buscando una respuesta a esta pregunta y pensé en publicar para futuras referencias.
Diferentes fuentes afirman cosas diferentes. Esto es básicamente una combinación de lo que he encontrado…
Si agregamos toda la sangre al agua destilada pura, todas las células eventualmente se abrirán debido a la presión osmótica. Así que tenemos que modificar el procedimiento porque solo queremos que los glóbulos rojos se lisen.
NH4Cl: Hace que los glóbulos rojos se hinchen, porque la penetración de NH3 induce un intercambio transmembrana entre iones Cl y OH.
KHCO3: Aumenta la tasa de inflamación de los glóbulos rojos y también puede servir como un componente tampón.
EDTA: Se une a Mg + 2 y Ca+2, lo que desestabiliza la membrana de los glóbulos rojos, pero no afecta tanto a los glóbulos blancos, por lo que nos permite apuntar solo a los glóbulos rojos. También es un detergente salino que eventualmente regulará la acidez y la osmolaridad del lisado,y protege nuestro ADN de las nucleasas (al unirse a los iones que sirven como cofactores para estas enzimas).
El punto principal era probablemente hacer algún tipo de tampón, que sea seguro para otras células, pero explotar las características específicas de los glóbulos rojos, su capacidad limitada para soportar el estrés osmótico.
El raeson para la adición de EDTA también puede ser más la inhibición de enzimas degradadoras liberadas de células rotas, en lugar de ayudar a la lisis.
Hola,
algunos renacimiento de este viejo tema.. ¿Alguien sabe cómo detener la lisis de las células con este tampón? Utilizo el búfer ACK para lisar glóbulos rojos después del aislamiento Ficoll de PBMCS. La cosa es, que si excedemos el tiempo de 5 minutos para la lisis, los PBMC también sufren y necesito agregar trypan blue y correr a otra habitación para contar células a través de la máquina TC20. Por lo tanto, me pregunto qué tan representativo es el recuento que obtengo si el búfer ACK sigue actuando hasta que el TC20 da mi resultado en duplicado….?
Gracias de antemano!
Su mejor opción sería lavar los PBMC en un búfer antes de comenzar a contar: Girar las celdas, eliminar el búfer ACK, reemplazar con PBS o una solución similar (por ejemplo, Ringer?), luego toma una alícuota para contar.