Salut les gens! Je me demandais si quelqu’un pouvait me dire comment fonctionne le tampon de lyse des globules rouges. Quelle est la fonction des ingrédients?
J’ai utilisé cette recette:
1 l ddH20
8,26 g de Chlorure d’ammonium (NH4Cl)
1 g de bicarbonate de potassium (KHCO3)
0,037 g d’EDTA
pH 7,3
La rumeur veut que cela ait quelque chose à voir avec l’activité Na + / K + ATPase, mais ce n’est pas aussi détaillé que je voudrais savoir comment cela fonctionne.
J’apprécierais beaucoup une explication du fonctionnement de ce tampon, ou peut-être un indice sur l’endroit où je peux trouver de la littérature, ou similaire, à ce sujet.
Merci!
Allez les gars! 80 vues et pas une seule réponse! Ma question n’est-elle pas claire? Se pourrait-il que personne ne sache ou ne prenne aucun soin du corps pour aider un gars?Juste un indice sur l’endroit où je pourrais lire à ce sujet serait également très apprécié!
L’autre option est que beaucoup de ces 80 téléspectateurs ont passé du temps à étudier cela pour vous (comme moi, qui a passé plus d’une heure sur Internet à essayer de le savoir) et n’a rien trouvé de plus détaillé que ce que vous savez déjà……….
leelee le Ven Nov 12 07:43:39 2010 a dit:
Eh bien, c’est aussi possible, je suppose. Je m’excuse auprès de tous ceux qui ont essayé de m’aider, et je vous remercie également pour votre temps et vos efforts!
Désolé de faire revivre un tel et ancien fil, mais moi aussi j’étais intéressé à connaître la réponse. Sur un autre forum, quelqu’un utilise du Tris au lieu du biocarbonate de potassium et cela a toujours fonctionné, donc je ne vois pas comment cela pourrait provenir des pompes Na + / K +
http://www.scienceforums.net/topic/13565-rbc-lysis/
Cher CTC,
Veuillez vous référer à la référence ci-dessous:-
http://ir.library.oregonstate.edu/xmlui/bitstream/handle/1957/13985/Schreck.AnalysisSalmonidLeukocytes.pdf?sequence=3
Le bit important est: –
Les érythrocytes de mammifères placés dans de l’eau distillée
vont gonfler jusqu’à ce qu’à un moment critique, la pression croissante
à l’intérieur de la cellule submerge la force de traction
de la membrane cellulaire et l’hémoglobine s’échappe
(hémolyse). Delano (1995) a développé un modèle
pour prédire l’ensemble critique des conditions physiques
qui entraînent la rupture osmotique des érythrocytes
de mammifères. Le modèle a déterminé que le devenir
de l’érythrocyte dans une solution hypotonique dépend
de la tonicité, de la sphéricité initiale de la cellule,
de la fraction initiale de son volume non occupée par
d’eau et de la quantité fractionnaire maximale par
dont la surface peut être étirée.
Nous utilisons votre tampon de lyse (NH4CL) pour éliminer les globules rouges de l’isolement Ficoll-Paque du sang total. Les RBC sont un contaminant indésirable comme nous le sommes après les Neutrophiles, les Monocytes, les Plaquettes, etc. En utilisant ce tampon de lyse, ces cellules ne sont pas activées de manière à ruiner nos expériences, c’est-à-dire la dégranulation et la chimiotaxie des neutraphiles.
J’espère que cela vous donnera une meilleure compréhension de ce qui est impliqué dans la lyse hypotonique de RBC
Cordialement
Uncle Rhombus
Salut !
J’ai passé les dernières heures à chercher une réponse à cette question et j’ai pensé poster pour référence future.
Différentes sources prétendent des choses différentes. C’est essentiellement une combinaison de ce que j’ai trouvé…
Si nous ajoutons le sang total à de l’eau distillée pure, toutes les cellules finiront par éclater sous l’effet de la pression osmotique. Nous devons donc modifier la procédure car nous voulons seulement que les globules rouges lysent.
NH4Cl: Il fait gonfler le RBC, car la pénétration du NH3 induit un échange transmembranaire entre les ions Cl et OH.
KHCO3: Il augmente le taux de gonflement des globules rouges et peut également servir de composant tampon.
EDTA: Il se lie au Mg + 2 et au Ca + 2, ce qui déstabilise la membrane des globules blancs, mais n’affecte pas autant les globules blancs, ce qui nous permet de cibler uniquement les globules blancs. Est également un détergent salin qui régulera éventuellement l’acidité et l’osmolarité du lysat, et protégera notre ADN des nucléases (en se liant aux ions qui servent de cofacteurs à ces enzymes).
Le point principal était probablement de fabriquer une sorte de tampon, sans danger pour d’autres cellules, mais d’exploiter les caractéristiques spécifiques des CBR, leur capacité limitée à résister au stress osmotique.
Le raeson pour l’addition d’EDTA peut également être davantage l’inhibition des enzymes dégradantes libérées par les cellules rompues, plutôt que d’aider à la lyse.
Bonjour,
un peu de renouveau de ce vieux sujet.. Quelqu’un sait-il un moyen d’arrêter la lyse des cellules par ce tampon? J’utilise un tampon ACK pour lyser les RBC après l’isolation Ficoll des PBMC. Le fait est que si nous dépassons le temps de 5 minutes pour la lyse, les PBMC souffrent également et je dois ajouter du bleu trypan et courir dans une autre pièce pour compter les cellules via la machine TC20. Donc, je me demande à quel point le nombre que j’obtiens est représentatif si le tampon ACK agit toujours jusqu’à ce que le TC20 donne mon résultat en double….?
Merci d’avance !
Votre meilleur pari serait de laver les PBMC dans un tampon avant de commencer à compter: Essorez les cellules, retirez le tampon ACK, remplacez-le par du PBS ou une solution similaire (par exemple Ringer?), puis prenez une aliquote pour le comptage.