Ciao gente! Mi chiedevo se qualcuno potesse dirmi come funziona il tampone di lisi dei globuli rossi. Che funzione hanno gli ingredienti?
Ho usato questa ricetta:
1 l ddH20
8.26 g Cloruro di ammonio (NH4Cl)
1 g Bicarbonato di potassio (KHCO3)
0.037 g EDTA
pH 7.3
Si dice che abbia qualcosa a che fare con l’attività dell’ATPasi Na+/K+, ma questo non è così dettagliato come vorrei sapere come funziona.
Apprezzerei molto una spiegazione su come funziona questo buffer, o forse un suggerimento su dove posso trovare litterature, o simili, su questo.
Grazie!
Forza ragazzi! 80 visualizzazioni e non una sola risposta! La mia domanda non è chiara? Potrebbe essere che nessuno sa o non ha alcuna cura del corpo per aiutare un ragazzo fuori?Solo un suggerimento su dove ho potuto leggere su di esso sarebbe molto apprezzato pure!
L’altra opzione è che molti di questi spettatori di 80 post hanno trascorso un po ‘ di tempo a esaminarlo per te (come me, che ho trascorso più di un’ora su Internet cercando di scoprirlo) e non sono riusciti a trovare nulla di più dettagliato di quello che già sai……….
leelee il Ven Novembre 12 07: 43: 39 2010 detto:
Beh, questo è anche possibile, immagino. Mi scuso con tutti voi brave persone che hanno cercato di aiutarmi, e vi ringrazio anche per il vostro tempo e fatica!
Mi dispiace far rivivere tale e vecchio filo, ma anch’io ero interessato a conoscere la risposta. Su un altro forum, qualcuno usa Tris invece di potassio biocarbonate e ancora lavorato, quindi non vedo come potrebbe essere da Na+/K+ pompe
http://www.scienceforums.net/topic/13565-rbc-lysis/
Cari CTC,
si Prega di fare riferimento al riferimento di seguito:-
http://ir.library.oregonstate.edu/xmlui/bitstream/handle/1957/13985/Schreck.AnalysisSalmonidLeukocytes.pdf?sequence=3
Il bit importante è:-
Mammiferi eritrociti messo in acqua distillata
si gonfiano fino a un certo punto critico, il rising
pressione all’interno della cellula travolge la resistenza alla trazione
resistenza della membrana cellulare e di emoglobina sfugge
(emolisi). Delano (1995) ha sviluppato un modello
per prevedere l’insieme critico di condizioni fisiche
che provocano la rottura osmotica degli eritrociti di mammifero
. Il modello ha determinato che il destino
dell’eritrocita in una soluzione ipotonica dipende
dalla tonicità, dalla sfericità iniziale della cellula,
dalla frazione iniziale del suo volume non occupata da
acqua e dalla quantità frazionaria massima di
che l’area superficiale può essere allungata.
Abbiamo utilizzato il buffer di lisi (NH4CL) per rimuovere i globuli rossi dall’isolamento Ficoll-Paque del sangue intero. Gli RBC sono un contaminante indesiderato come siamo dopo neutrofili, monociti, piastrine ecc. Usando questo tampone di lisi queste cellule non vengono attivate in alcun modo da rovinare i nostri esperimenti, cioè la degranulazione e la chemiotassi dei neutrofili.
Spero che questo ti dia un po ‘ più di comprensione di ciò che è coinvolto nella lisi ipotonica di RBC
Cordiali saluti
Uncle Rhombus
Ciao!
Ho passato le ultime ore a cercare una risposta a questa domanda e ho pensato di postare per riferimento futuro.
Diverse fonti affermano cose diverse. Questa è fondamentalmente una combinazione di ciò che ho trovato…
Se aggiungiamo il sangue intero all’acqua distillata pura, tutte le cellule alla fine si apriranno a causa della pressione osmotica. Quindi dobbiamo modificare la procedura perché vogliamo solo che i globuli rossi si lisino.
NH4Cl: Fa gonfiare l’RBC, perché la penetrazione di NH3 induce uno scambio transmembrana tra ioni Cl e OH.
KHCO3: Aumenta il tasso di rigonfiamento di RBC e può anche servire come componente tampone.
EDTA: Si lega a Mg + 2 e Ca + 2, che destabilizza la membrana RBC, ma non influisce tanto sui globuli bianchi, quindi ci consente di indirizzare solo l’RBC. È anche un detergente salino che alla fine regolerà l’acidità e l’osmolarità del lisato e protegge il nostro DNA dalle nucleasi (legandosi agli ioni che fungono da cofattori per questi enzimi).
Il punto principale era probabilmente quello di fare una sorta di buffer, che è sicuro per altre cellule, ma sfruttare le caratteristiche specifiche dei globuli rossi, la loro limitata capacità di resistere allo stress osmotico.
Il raeson per l’aggiunta di EDTA può essere anche più l’inibizione degli enzimi degradanti rilasciati dalle cellule rotte, piuttosto che aiutare la lisi.
Ciao,
qualche rinascita di questo vecchio argomento.. Qualcuno conosce un modo per fermare la lisi delle cellule da questo buffer? Io uso il buffer ACK per lyse RBCS dopo l’isolamento Ficoll di PBMCs. Il fatto è che se superiamo il tempo di 5 minuti per la lisi, anche i PBMC soffrono e ho bisogno di aggiungere trypan blue e correre in un’altra stanza per contare le celle tramite la macchina TC20. Quindi, mi chiedo quanto sia rappresentativo il conteggio che ottengo se il buffer ACK agisce ancora fino a quando il TC20 non dà il mio risultato in duplicato….?
Grazie in anticipo!
La soluzione migliore sarebbe quella di lavare i PBMC in un buffer prima di iniziare a contare: ruotare le celle, rimuovere il buffer ACK, sostituire con PBS o soluzione simile (ad es.?), quindi prendi un’aliquota per il conteggio.