Quanto tempo ci vuole per produrre anticorpi monoclonali?

Gli anticorpi monoclonali possono essere prodotti in molte linee cellulari differenti alle nostre facilità. Ma preferiamo le linee cellulari dell’ovaio di criceto cinese (CHO) o del rene embrionale umano (HEK) a causa della loro crescita robusta e della capacità di eseguire glicosilazione simile all’uomo sul dominio Fc degli anticorpi monoclonali.

Il nostro flusso di lavoro ottimizzato e le scadenze per la produzione di anticorpi monoclonali possono essere dettagliate come segue:

1. Sequenziamento anticorpale quando le sequenze non sono ancora disponibili (2-3 settimane per regioni variabili e sequenze leader; 3-4 settimane per il full-length sequence)
   1. Da proteine purificate (spettri di massa di sequenziamento)
   2. Da linee di cellule di ibridoma (trascrittomica di sequenziamento)
2. la Scelta di un adeguato di vettore di espressione, genica, sintesi, e la clonazione di anticorpi anti-codifica geni – a partire da 2-3 settimane
3. Trasfezione
   1. espressione Transitoria per progetti a breve termine o medio/piccola scala di produzione (a partire da 3-4 settimane)
   2. linea cellulare Stabile generazione per progetti a lungo termine, commerciali e di produzione di grandi dimensioni (a partire da 5 mesi)
4. Scale-up e purificazione della produzione (i tempi di consegna dipendono dalla quantità)

L’espressione transitoria degli anticorpi monoclonali è sufficiente per la maggior parte delle applicazioni. In questi casi, a seconda della resa e dei livelli di purezza richiesti, le fasi di trasfezione, produzione, purificazione (passaggi 4 e 5 nel processo descritto sopra) iniziano da 3 a 4 settimane. Gli anticorpi monoclonali prodotti dall’espressione transitoria sono utilizzati in studi preliminari di caratterizzazione, progetti di ricerca e test preclinici.

Al contrario, quando gli anticorpi sono destinati ad applicazioni terapeutiche o per essere utilizzati come componenti di diagnostica in vitro e dispositivi medici, devono essere generate linee cellulari stabili. In questi casi, la trasfezione, lo screening e la sottoclonazione iniziano a 5-6 mesi. Le principali sfide di qualsiasi processo di generazione di linee cellulari stabili derivano dal processo laborioso e dispendioso in termini di tempo di selezione del monoclone e conferma della stabilità.

In dettaglio, dopo la trasfezione di vector, vengono ottenuti e amplificati pool stabili (una miscela di diversi cloni). La caratterizzazione preliminare di questi pool consente ai ricercatori di identificare quelli con la resa di produzione più elevata e coerente. Successivamente, vengono selezionati pool altamente produttivi per l’isolamento monoclonico. I monocloni sono definiti come una sottopopolazione specifica originata da una singola cellula, quindi i monocloni condividono lo stesso background genetico con vettori stabilmente integrati e rese di produzione simili.

Garantire la “clonalità” può essere particolarmente impegnativo quando si lavora con linee cellulari di mammiferi a causa della difficoltà di isolare le singole cellule. Attualmente, monoclone isolamento a ProteoGenix può essere eseguita utilizzando uno dei due principali strategie:

• Monoclone di selezione utilizzando il metodo di diluizione limitante (a partire da 4 mesi) – questo metodo è il tradizionale approccio di monoclone di selezione e richiede diversi giri di diluizione e di amplificazione per limitare la densità delle cellule di ogni bene al minimo (idealmente una cella per bene). Sebbene meno costoso di altri metodi, limitare la diluizione presenta importanti inconvenienti, tra cui il fatto che può essere estremamente laborioso e dispendioso in termini di tempo. Inoltre, limitare il numero di cellule per pozzetto mediante diluizione consentirà solo l’isolamento dei cloni più abbondanti, che potrebbero non essere quelli più produttivi.
• Selezione del monoclone facendo uso del metodo verificato di semina del piatto in-Situ (VIPS™) (a partire da 4 mesi) – il metodo di VIPS™ è un approccio avanzato alla selezione del monoclone. È meno laborioso dell’approccio convenzionale; tuttavia, richiede l’uso di attrezzature specializzate. L’attrezzatura di VIPS™ è stata destinata per seminare automaticamente le singole cellule in 96 o 384 micropiastre del pozzo. In contrasto con il metodo tradizionale, la maggior parte dei singoli cloni sono isolati e valutati prima dell’amplificazione consentendo ai ricercatori di scegliere i migliori candidati – che potrebbero non essere quelli più abbondanti.

Dato il minor numero di cicli di amplificazione dei cloni, il metodo VIPS™ consente un approccio più rapido e robusto allo screening e alla selezione dei monocloni. Inoltre, la generazione di linee cellulari stabili, che inizia a 5-6 mesi, può essere ridotta con successo di diverse settimane.