przeciwciała monoklonalne mogą być wytwarzane w wielu różnych liniach komórkowych w naszych placówkach. Preferujemy jednak linie komórkowe jajnika chomika chińskiego (CHO) lub ludzkiej nerki zarodkowej (HEK) ze względu na ich silny wzrost i zdolność do wykonywania ludzkiej glikozylacji na domenie Fc przeciwciał monoklonalnych.
nasz zoptymalizowany przepływ pracy i terminy produkcji przeciwciał monoklonalnych można wyszczególnić w następujący sposób:
- sekwencjonowanie przeciwciał, gdy sekwencje nie są jeszcze dostępne (2-3 tygodnie dla zmiennych regionów i sekwencji leader; 3-4 tygodnie dla sekwencji pełnej długości)
- z oczyszczonych białek (sekwencjonowanie oparte na widmach masowych)
- z linii komórkowych hybridoma (sekwencjonowanie oparte na transkryptomice)
- wybór odpowiedniego wektora ekspresyjnego, synteza genów i klonowanie genów kodujących przeciwciało-począwszy od 2-3 tygodni
- transfekcja
- przemijająca ekspresja dla projektów krótkoterminowych lub produkcji na małą / średnią skalę (począwszy od 3-4 tygodni)
- stabilne wytwarzanie linii komórkowej dla projektów długoterminowych, produkcji komercyjnej i produkcji na dużą skalę (począwszy od 5 miesięcy)
- zwiększenie skali produkcji i oczyszczanie (czas realizacji zależy od ilości)
przemijająca ekspresja przeciwciał monoklonalnych jest wystarczająca dla większości zastosowań. W tych przypadkach, w zależności od wymaganego poziomu wydajności i czystości, etapy transfekcji, produkcji, oczyszczania (etapy 4 i 5 w procesie opisanym powyżej) rozpoczynają się od 3 do 4 tygodni. Przeciwciała monoklonalne wytwarzane przez ekspresję przejściową są stosowane we wstępnych badaniach charakterystyki, projektach badawczych i testach przedklinicznych.
natomiast, gdy przeciwciała są przeznaczone do zastosowań terapeutycznych lub do stosowania jako składniki diagnostyki in vitro i wyrobów medycznych, należy wytworzyć stabilne linie komórkowe. W tych przypadkach transfekcja, badania przesiewowe i subklonowanie zaczynają się od 5-6 miesięcy. Główne wyzwania każdego stabilnego procesu generowania linii komórkowych wynikają z pracochłonnego i czasochłonnego procesu selekcji monoklonu i potwierdzenia stabilności.
szczegółowo, po transfekcji wektora, otrzymuje się i amplifikuje stabilne pule (mieszaninę kilku klonów). Wstępna charakterystyka tych pul pozwala naukowcom zidentyfikować te, które mają najwyższą i najbardziej spójną wydajność produkcji. Następnie wybiera się wysoce wydajne baseny do izolacji monoklonów. Monoklony definiuje się jako specyficzną subpopulację pochodzącą z pojedynczej komórki, zatem monoklony mają to samo tło genetyczne ze stabilnie zintegrowanymi wektorami i podobnymi plonami produkcji.
zapewnienie „klonalności” może być szczególnie trudne podczas pracy z liniami komórkowymi ssaków ze względu na trudności w izolowaniu pojedynczych komórek. Obecnie izolację monoklonu w ProteoGenix można przeprowadzić przy użyciu jednej z dwóch głównych strategii:
- wybór Monoklonu przy użyciu metody rozcieńczania granicznego – począwszy od 4 miesięcy) – ta metoda jest konwencjonalnym podejściem do wyboru monoklonu i wymaga kilku rund rozcieńczania i amplifikacji w celu ograniczenia gęstości komórek w każdej studzience do minimum (najlepiej po jednej komórce na studzienkę). Chociaż mniej kosztowne niż inne metody, ograniczenie rozcieńczenia ma ważne wady, w tym fakt, że może być bardzo pracochłonne i czasochłonne. Co więcej, ograniczenie liczby komórek na studzienkę przez rozcieńczenie umożliwi tylko izolację najliczniejszych klonów – które mogą nie być najbardziej produktywne.
- wybór Monoklonu przy użyciu metody Verified In-Situ Plate Seeding (VIPS™) (od 4 miesięcy) – metoda VIPS™ jest zaawansowanym podejściem do wyboru monoklonu. Jest mniej pracochłonny niż konwencjonalne podejście; wymaga jednak użycia specjalistycznego sprzętu. Sprzęt VIPS™ został zaprojektowany do automatycznego wysiewania pojedynczych komórek do 96 lub 384 mikropłytek. W przeciwieństwie do tradycyjnej metody, większość pojedynczych klonów jest izolowana i oceniana przed amplifikacją, umożliwiając naukowcom wybór najlepszych kandydatów-które mogą nie być najliczniejsze.
biorąc pod uwagę mniejszą liczbę cykli amplifikacji klonów, metoda VIPS™ umożliwia szybsze i bardziej solidne podejście do przesiewania i selekcji monoklonów. Co więcej, stabilne generowanie linii komórkowej, które rozpoczyna się od 5-6 miesięcy, można z powodzeniem zmniejszyć o kilka tygodni.