Cześć ludzie! Zastanawiałem się, czy ktoś mógłby mi powiedzieć, jak działa bufor do lizy czerwonych krwinek. Jaką funkcję pełnią składniki?
użyłem tego przepisu:
1 l ddH20
8,26 g chlorek amonu (NH4Cl)
1 g wodorowęglan potasu (KHCO3)
0,037 G EDTA
pH 7,3
plotka głosi, że ma to coś wspólnego z aktywnością na+/K+ATPazy, ale nie jest to tak szczegółowe, jak chciałbym wiedzieć, jak to działa .
byłbym bardzo wdzięczny za wyjaśnienie, jak działa ten bufor, a może podpowiedź, gdzie mogę znaleźć litterature, lub tym podobne.
dzięki!
dalej chłopaki! 80 wyświetleń i ani jednej odpowiedzi! Czy moje pytanie jest niejasne? Czy to możliwe, że nikt nie zna ani nie pielęgnuje ciała, aby pomóc facetowi?Tylko podpowiedź, gdzie mógłbym o tym przeczytać, byłaby również bardzo mile widziana!
inną opcją jest to, że wielu z tych widzów postów 80 poświęciło trochę czasu na sprawdzenie tego dla Ciebie (jak ja, który spędził ponad godzinę w Internecie, próbując się tego dowiedzieć) i nie mogłem znaleźć niczego bardziej szczegółowego niż to, co już wiesz……….
leelee on Fri Nov 12 07:43: 39 2010 said:
to też możliwe. Przepraszam was wszystkich miłych ludzi, którzy próbowali mi pomóc, a także dziękuję za Wasz czas i wysiłek!
Przepraszam, że ożywiam taki i stary wątek, ale ja też byłem zainteresowany poznaniem odpowiedzi. Na innym forum ktoś używa Tris zamiast biowęglanu potasu i nadal działa, więc nie wiem jak to może być z pomp Na+ / K+
http://www.scienceforums.net/topic/13565-rbc-lysis/
drogi CTC,
proszę zapoznać się z poniższym odnośnikiem:-
http://ir.library.oregonstate.edu/xmlui/bitstream/handle/1957/13985/Schreck.AnalysisSalmonidLeukocytes.pdf?sequence=3
ważne jest: –
erytrocyty ssaków umieszczone w wodzie destylowanej
będą pęcznieć, aż w pewnym krytycznym punkcie wzrost
ciśnienia we wnętrzu komórki przytłacza wytrzymałość
błony komórkowej, a hemoglobina ucieka
(hemoliza). Delano (1995) opracował model
do przewidywania krytycznego zestawu warunków fizycznych
, które skutkują osmotycznym pęknięciem erytrocytów ssaków
. Model ten wykazał, że
los erytrocytów w roztworze hipotonicznym zależy
od toniczności, początkowej sferyczności komórki,
początkowej frakcji jego objętości nie zajmowanej przez
wodę i maksymalnej ilości ułamkowej
, którą można rozciągnąć.
używamy bufora lizy (NH4CL) do usuwania czerwonych krwinek z izolacji pełnej krwi Ficoll-Paque. RBC są niepożądanym zanieczyszczeniem, ponieważ jesteśmy po neutrofilach, monocytach, płytkach krwi itp. Dzięki zastosowaniu bufora lizy komórki te nie są aktywowane w żaden sposób, aby zniszczyć nasze eksperymenty, tj. degranulację i chemotaksję Neutraphils.
mam nadzieję, że to da ci więcej zrozumienia, co jest związane z hipotoniczną Lizą RBC
Pozdrawiam serdecznie
Wujek romb
cześć!
spędziłem ostatnie kilka godzin szukając odpowiedzi na to pytanie i pomyślałem, że opublikuję ją w przyszłości.
różne źródła podają różne rzeczy. To w zasadzie kombinacja tego, co znalazłem…
jeśli dodamy całą krew do czystej wody destylowanej, wszystkie komórki ostatecznie pękną z powodu ciśnienia osmotycznego. Więc musimy zmodyfikować procedurę, ponieważ chcemy tylko, aby czerwone krwinki się lizyły.
NH4Cl: powoduje pęcznienie RBC, ponieważ penetracja NH3 indukuje wymianę przezbłonową między jonami CL i OH.
KHCO3: zwiększa szybkość pęcznienia RBC i może również służyć jako składnik bufora.
EDTA: Wiąże się z Mg+2 i Ca+2, Co destabilizuje błonę RBC, ale nie wpływa na białe krwinki tak bardzo, więc pozwala nam celować tylko w RBC. Jest również detergentem solnym, który ostatecznie reguluje kwasowość i osmolarność lizatu i chroni nasze DNA przed nukleazami (poprzez wiązanie z jonami, które służą jako kofaktory dla tych enzymów).
głównym celem było prawdopodobnie stworzenie pewnego rodzaju bufora, który jest bezpieczny dla innych komórek, ale wykorzystuje specyficzne cechy RBC, ich ograniczoną zdolność do wytrzymywania stresu osmotycznego.
raeson do dodawania EDTA może być również bardziej hamowaniem enzymów degradacyjnych uwalnianych z pękniętych komórek, niż wspomaganiem lizy.
Witam,
trochę ożywienia tego starego tematu.. Czy ktoś zna sposób na zatrzymanie lizy komórek przez ten bufor? Używam bufora ACK do lyse RBC po Ficoll izolacji PBMC. Chodzi o to, że jeśli przekroczymy czas lizy 5 minut, PBMC również ucierpią i muszę dodać trypan blue i uruchomić do innego pomieszczenia, aby policzyć komórki za pomocą maszyny TC20. Zastanawiam się więc, jak reprezentatywna jest liczba, którą otrzymuję, jeśli bufor ACK nadal działa, dopóki TC20 nie da mi wyniku w duplikacie….?
z góry dziękuję!
najlepiej byłoby umyć PBMC w buforze przed rozpoczęciem liczenia: obrócić komórki, usunąć bufor ACK, zastąpić PBS lub podobnym rozwiązaniem (np.), następnie weź aliquot do liczenia.